本文以改进CTAB法提取的总RNA为模板,通过设计茎环反转录引物,利用定量RT-PCR技术从黑杨幼嫩叶片、成熟叶片中均检测到miRNA。结果表明,miR159、miR167、miR171、miR319在三倍体幼叶中表达量均高于二倍体,miR164在三倍体成熟叶片中的表达量高于二倍体表达量。除miR319外,其余miRNA与其相应的靶基因在二倍体和三倍体黑杨不同阶段叶片中表达的消长关系都较为典型。暗示这些miRNA 靶基因可能与黑杨三倍体的速生性状形成相关。

本研究以黑杨中林46三倍体为材料,依据前期表达谱芯片的分析结果,分离克隆得到三倍体材料中高表达基因PtSIP3,该基因的编码产物为钙调磷酸酶B(Calcineurin B-like Proteins,简称CBL)的靶蛋白。随后构建了双元表达载体pRI101-PtSIP3,并成功的转入拟南芥中。经qRT-PCR表达分析和表型观察,发现PtSIP3 在拟南芥中异源过表达会抑制胚和果荚的发育、促进根的快速伸长。推测该基因在黑杨三倍体中的表达升高,可能会参与黑杨三倍体的营养生长期的调控并促进根的发育。

利用甲基化敏感扩增多态性技术,对二倍体与三倍体黑杨和白杨群体DNA甲基化进行了研究,共检测到745个基因位点,不同倍性杨树群体基因组DNA的总甲基化率为13.69% 18.84%,二倍体杨树平均为14.71%,三倍体杨树平均为17.72%。不同倍性杨树种群总甲基化率随着倍性的升高而升高,半甲基化率黑杨组也随着倍性的升高而升高,而白杨组正好相反;黑杨组全甲基化率没有明显的规律可循,而白杨组的全甲基化率则随着倍性的升高而升高。倍性与甲基化率的相关性验证分析结果表明:总甲基化率与倍性的相关系数为0.835,PPP>0.05,半甲基化率与倍性相关性较弱。不同倍性杨树群体的甲基化变异与序列变化具有显著相关性(r=0.910 3,P<0.01),推测甲基化变异具有种群特异性。

利用同源序列克隆技术,分离了三倍体黑杨中4类(MET、CMT、DRM、DNMT2)8个特异甲基转移酶片段,其中,5个片段与二倍体同源性达到100%,3个片段发生了剪切变化。通过实时定量PCR技术检测8个甲基转移酶在不同倍性、不同部位、不同生长时期间表达模式的差异,通过对5个不同部位基因表达的检测,表明不同倍性黑杨在相同的部位可能由不同种类的甲基转移酶参与主要的甲基化调控。通过分析植株从分化早期的茎尖到分化晚期的叶和茎整个生长过程中基因表达的情况,发现随着时间的推移,MET家族 (PnD1和PnD2) 基因可能是拮抗调节,CMT (PnD3和PnD4) 家族基因可能是协同调节;而隶属于DNMT2家族的PnD6基因在各部位的表达都比较弱,唯独三倍体茎尖有很高的表达。由于茎尖是生长旺盛的部位,PnD6有可能是影响三倍体速生的重要基因。这些结果可能暗示,DNA甲基转移酶基因可能参与了黑杨发育过程中叶片形态发生的过程。